中关村NMT联盟“一带一路”全国测试服务网络测试服务信息

4月8日,某研究所将NMT技术应用于钙信号研究,测试样品为小麦,测试指标为Ca2+,在旭月研究院完成实验。| 5月9号,某研究院将NMT技术应用于逆境生理领域,测试样品为黄瓜幼苗,测试指标为NO3-、NH4+,在旭月研究院完成实验。| 6月2号,某研究院将NMT技术应用于逆境胁迫领域,测试样品为棉花苗,测试指标为Ca2+、H+、K+、Na+、IAA,在旭月研究院完成实验。| 6月5号,某研究院将NMT技术应用于植物逆境领域,测试样品为苜蓿,测试指标为K+,在旭月研究院完成实验。| 6月9号,某研究所将NMT技术应用于水稻逆境领域,测试样品为水稻,测试指标为Na+、Ca2+,在中国科学院植物研究所完成实验。| 6月11号,某研究院将NMT技术应用于植物抗逆领域,测试样品为酵母细胞,测试指标为IAA,在旭月研究院完成实验。| 6月16号,某高校将NMT技术应用于昆虫研究,测试样品为昆虫,测试指标为Ca2+、K+,在旭月研究院完成实验。| 6月19号,某研究院将NMT技术应用于植物抗逆领域,测试样品为拟南芥,测试指标为Ca2+,在旭月研究院完成实验。|

Nat Cell Biol经典回顾:NMT发现神经元线粒体耗O2速率增加为Bcl2家族改善神经元代谢提供直接证据


微信原图文

预存多赠5% 还有生活大礼!给自己预定一个创新的机会

NMT作为生命科学底层核心技术,是建立活体创新科研平台的必备技术。2005年~2020年,NMT已扎根中国15年。2020年,中国NMT销往瑞士苏黎世大学,正式打开欧洲市场。

基本信息

主题:NMT发现神经元线粒体耗O2速率增加为Bcl2家族改善神经元代谢提供直接证据

期刊:Nature cell biology

影响因子:20.042

研究使用平台:NMT神经研究创新平台

标题:Bcl-xL regulates metabolic efficiency of neurons through interaction with the mitochondrial F1F0 ATP synthase

作者:耶鲁大学Elizabeth A. Jonas、Kambiz N. Alavian

 

检测离子/分子指标

O2


检测样品

大鼠海马神经元

 

 

中文摘要(谷歌机翻)

抗凋亡Bcl2家族蛋白(例如Bcl-xL)通过隔离凋亡分子来保护细胞免于死亡,但也有助于正常的神经元功能。本研究在海马神经元中发现Bcl-xL增强了能量代谢的效率。研究的证据表明,Bcl-xL与F1F0ATP合酶的β亚基直接相互作用,减少了F1F0 ATPase复合物中的离子泄漏,从而在F1F0 ATPase活性期间增加了F1F0H+的净转运。通过膜片钳富含F1F0 ATP合酶复合物的线粒体囊泡,研究发现,在存在ATP的情况下,Bcl-xL活性的药理或遗传抑制作用会增加膜泄漏电导。此外,重组Bcl-xL蛋白直接增加了纯化的合酶复合物的ATPase活性水平,而抑制内源性Bcl-xL则降低了F1F0酶活性水平。本研究的发现表明,线粒体代谢效率的提高有助于表达Bcl-xL的神经元中突触效能的提高。

 

 

离子/分子流实验处理

① GFP-Bcl-xL表达神经元与mito-GFP表达神经元CSCW2-荧光素酶慢病毒转染7 d

② 单个不表达神经元或表达Bcl-xL shRNA或混乱shRNA的神经元CSCW2-荧光素酶慢病毒转染7 d

③ 单个神经元10 μM ABT-737处理18 h

④ 90 mM KCl和5 mg ml-1寡霉素处理表达Bcl-xL-GFP或mito-GFP的单个神经元

⑤ 萤火虫荧光素酶在有无1 μM ABT-737处理海马神经元中的发光5 min,随后用90 mM KCl处理90 s。

 

 

离子/分子流实验结果

先前的工作描述了过表达Bcl-xL的神经元中线粒体生物量的增加。如果线粒体生物量的增加是造成ATP水平升高的唯一原因,那么表达Bcl-xL的细胞有望增加摄氧量。为了验证这一点,使用O2流速微传感器检测单个神经元的氧摄取量。与预期相反,过表达Bcl-xL的神经元的O2流速低于转染mito-GFP的神经元(图1b),这表明过表达Bcl-xL的神经元更有效地将ATP的产生与O2的吸收结合。内源性Bcl-xL具有类似的作用,因为shRNA介导的消耗(图1c, d)或Bcl-xL活性的药理抑制作用(图1e)增加了神经元的O2流速。这些数据表明,Bcl-xL的消耗或抑制使ATP的产生与O2的摄取解偶联。

从理论上讲,较高的ATP水平和过表达Bcl-xL的神经元的O2摄取水平较低,可能是由于电活动和突触活动水平降低而导致ATP积累的静止状态。这不太可能,是因为Bcl-xL过表达的神经元具有比对照更大的突触和更多的自发活动。

因此,作者研究了过表达Bcl-xL的神经元是否具有更大但未被充分利用的能量。当细胞在高钾条件下去极化时,Bcl-xL过表达的神经元O2流速比基础水平增加了约90%,这是一种已知的刺激神经元电活动和突触活动的处理方法(图1f),而mito-GFP表达对照则仅增加了50%。

在氧化磷酸化过程中,从线粒体基质中泵出的质子通过ATP合成酶处的线粒体内膜的H+流速(生产流速)和H+外排(非生产性)重新进入基质。减少非生产性外排可提高ATP生产效率。为了确定Bcl-xL过表达的神经元在最大活性期间是否有不同程度的非生产性穿过内膜的外排,高钾被迅速冲洗出去,并在寡霉素中测量O2摄取量,寡霉素抑制与ATP生成相关的H+流速,但不抑制与非生产性外排相关的H+流速。与mito-GFP表达对照相比,GFP-Bcl-xL细胞具有更高的产O2流速与总O2流速的比值,表明它们利用更高的整体峰值O2流速百分比来制造ATP(图1g)。

图1. Bcl-xL改变神经元对O2的吸收

 

 

其他实验结果

  • Bcl-xL过表达的神经元ATP水平升高,Bcl-xL缺失的神经元ATP水平降低。

  • Bcl-xL是刺激引起的代谢变化所必需的。

  • Bcl-xL定位于线粒体内膜。

  • 重组Bcl-xL蛋白增强了F1F0 ATPase的酶促速率。
  • 在F1F0 ATPase活动期间,Bcl-xL抑制减弱H+进入亚线粒体囊泡。
  • 内源性Bcl-xL是ATP结合后抑制膜泄漏所必需的。

  • Bcl-xL增加线粒体ATP的产生,可使细胞在缺乏Bax或Bak的情况下免受代谢损害。

 

 

结论

本研究发现过表达Bcl-xL的神经元具有较高的ATP水平,而内源性Bcl-xL被消耗或抑制的细胞具有较低的ATP水平。尽管ATP水平升高,但过表达Bcl-xL的神经元耗氧量较少,Bcl-xL消耗增加了氧摄取水平。除其外膜定位外,研究通过免疫电镜在线粒体基质中发现Bcl-xL。Bcl-xL与F1F0 ATP合酶的β亚基免疫共沉淀,与纯化的F1 ATP合酶重组β亚基结合。外源施加Bcl-xL使F1F0 ATPase活性水平升高,Bcl-xL抑制使酶促速率降低。Bcl-xL缺失使含F1F0-ATPase的递质线粒体囊泡对H+离子的隔离能力下降,表明Bcl-xL消耗引起质子在激活该酶后外排。通过膜片钳检测暴露于ATP的含F1F0-ATPase的囊泡,记录到Bcl-xL被抑制或耗尽时外渗电导增加。因此,本研究提出了一个模型,其中Bcl-xL通过减少F1F0 ATPase中的质子外排来提高ATP合成的效率,从而改善神经元的新陈代谢。

 

 

测试液

90 mM KCl, 64 mM NaCl, 10 mM glucose, 10 mM HEPES, 2 mM CaCl2, pH 7.4

 

 

文章原文:https://www.nature.com/articles/ncb2330

 

2019版《NMT论文集》已出版

 

关键词:能量代谢、神经元、线粒体、F1F0、ATP