中关村旭月非损伤微测技术产业联盟 - 华中农业大学一区TOP期刊：利用高通量CRISPR/Cas9系统构建寄主植物抗虫突变体文库及广谱抗虫基因鉴定

华中农业大学一区TOP期刊：利用高通量CRISPR/Cas9系统构建寄主植物抗虫突变体文库及广谱抗虫基因鉴定

基本信息

期刊：Advanced Science

主题：高通量CRISPR/ cas9介导的大规模诱变文库鉴定出GhMLP423菌株，调节Ca²⁺和ROS来增强抗虫性

标题：Construction of Host Plant Insect-Resistance Mutant Library by High-Throughput CRISPR/Cas9 System and Identification of A Broad-Spectrum Insect Resistance Gene

影响因子：15.1

作者：华中农业大学棉花遗传育种团队孙琳 Muna Alariqi 王雅欣王琼琼许忠平 Muhammad Naeem Zafar 杨光琴贾若愚 Amjad Hussain Yilin Chen 丁霄周家伟王冠英王福秋李建英 Jiawei Zou 朱相潜余露孙艺文梁思佳惠凤娇 Luo Chen 郭伟锋（塔里木大学）王彦芹（塔里木大学）朱华国（黄冈师范学院） Keith Lindsey（杜伦大学）聂新辉（石河子大学）张献龙金双侠

供稿人简介

夏林杰，华中农业大学植物科学技术学院博士，主要从事植物抗逆与信号转导，导师杨细燕教授

中文摘要

昆虫对棉花产区构成重大挑战。研究描述了一个高通量CRISPR/ cas9介导的大规模诱变文库，该文库针对棉花内源抗虫相关基因，利用968个sgrna靶向502个先前鉴定的基因，产生了≈2000株T0植株，并实现了97.29%的基因组编辑和84.78%的有效遗传。研究鉴定出几个潜在的抗性相关突变体，这些突变体可能与棉虫分子相互作用有关。研究选择了139和144个对虫害抗性降低并靶向主要乳胶样蛋白423（GhMLP423）的菌株进行深入研究。GhMLP423的过表达通过激活水杨酸(SA)和致病相关(PR)基因的植物系统性获得性抗性(SAR)来增强昆虫抗性，这种激活是由细胞质钙[Ca²⁺]细胞通量升高引起活性氧(ROS)诱导的。实验结果显示，GhMLP423与细胞膜上的人表皮生长因子受体亚基15 (EPS15)蛋白相互作用，它们一起调节Ca²⁺和ROS的系统传播波，从而诱导SAR。该大型诱变文库为多倍体植物物种的功能基因组学研究提供了有效的策略，并为抗虫基因工程提供了坚实的平台。

叶片Ca2+实时转运速率实验方法（NMT实验）

转基因GhMLP423棉花（OE/CR/WT）苗期叶片，昆虫口器损伤/不损伤

叶片Ca2+实时转运速率实验结果（NMT实验）

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利用非损伤微测技术（NMT）研究了转基因GhMLP423棉花叶片在损伤前后Ca²⁺实时转运速率（图1a），结果表明，与JIN668相比，在超表达株系中，创伤诱导的细胞Ca²⁺实时转运速率显著高于JIN668，而基因敲除植株则表现出较低的伤害诱导细胞通量(图1a)。推测GhMLP423具有改变植物系统反应的能力，启动伤口信号识别，通过激活感应组织中的Ca^{2 +}信号，促进植物的防御系统。

图1 GhMLP423敲除(CR)、GhMLP423过表达(OE)和jin668(对照)幼苗在NMT正常和损伤(W)条件下棉花叶片Ca^{2 +}实时转运速率。流速值的正负号仅代表离子/分子转运方向，正值表示从叶肉细胞内排出到叶片质外体（细胞间隙），负值表示从叶片质外体吸收到叶肉细胞内。

与NMT数据相关性较高的其他实验结果

1、叶片Ca²⁺累积实验

用钙比色法测定损伤前后细胞系细胞内Ca²⁺的含量。结果表明，与JIN668相比，CR的Ca^{2 +}含量(0.14 mg g⁻¹和0.25 mg g⁻¹)显著低于JIN668 (0.55 mg g⁻¹和0.93 mg g⁻¹)，OE的Ca^{2 +}含量在伤前和伤后显著高于JIN668 (0.68 mg g⁻¹和2.02 mg g⁻¹)。伤前OE与JIN668植株Ca^{2 +}含量无显著变化。然而，OE植株损伤后Ca^{2 +}积累量比JIN668高2.1倍(图2)。

图2 CR、OE和JIN668在正常和损伤条件下叶片ca^{2 +}含量(mg g⁻¹)

2、叶片ROS累积实验

对8周龄的CR、OE和JIN668植株叶片进行过氧化氢(H2O2)DAB原位染色。DAB染色的OE叶颜色最深(图3c)，表明ROS积累较高，特别是在伤害部位(图3d)。此外，还对过氧化氢含量进行了定量，其结果与染色观察结果一致。OE组伤前和伤后H2O2水平分别是JIN668的4.6倍和2.6倍，而CR组分别是JIN668的1.2倍和2.2倍(图3e)。ROS的变化可能是由于[Ca²⁺] cyt通量的变化以及涉及GhMLP423诱导的免疫系统的两种信号通路的变化。

图3 (C)CR、OE和JIN668叶片DAB染色，零星的褐斑代表过氧化氢(H₂O₂)的积累。(D)CR、OE和JIN668叶片的DAB染色，零星的褐斑代表田间害虫取食部位过氧化氢(H₂O₂)的积累。 E)CR、OE和JIN668叶片中的H₂O₂含量(μmol/gFW)。gFW，绿色鲜重。数值为均数±SD；n=3。统计分析采用学生t检验p < 0.05。

其他实验结果