PC兰大何凯:NO3-、K+流及膜电位数据为揭示拟南芥SLAH3通过调节N-K平衡参与维持膜电位稳态提供关键支撑
基本信息
主题:NO3-、K+流及膜电位数据为揭示拟南芥SLAH3通过调节N-K平衡参与维持膜电位稳态提供关键支撑
期刊:The Plant Cell
影响因子:12.085
研究使用平台:NMT植物营养创新平台
标题:The anion channel SLAH3 interacts with potassium channels to regulate nitrogen–potassium homeostasis and the membrane potential in Arabidopsis
作者:兰州大学何凯、刘倍贝;首都师范大学冯长鑫
检测离子/分子指标
NO3-、K+、膜电位
检测样品
5日龄拟南芥根成熟区
中文摘要
氮-钾平衡在植物生长发育过程中至关重要,然而其分子机制尚不清楚。本研究发现,拟南芥中NO3-外排通道SLAH3突变导致对高浓度KNO3的耐受性增强。出乎意料的是,slah3突变体特异地耐受高浓度K+,而增加NO3-浓度导致野生型和slah3之间表型差异减小。slah3中NO3-外流减少,K+外流增强,证明SLAH3介导的NO3-转运和SLAH3影响的K+流动在调控NO3--K+平衡的过程中至关重要。进一步研究发现,钾离子外排通道GORK/SKOR与SLAH3相互作用。gork/skor突变体在高K+条件下表现出超敏感表型。高K+处理后,相对于野生型,突变体slah3的去极化减弱,gork/skor的去极化增强,表明NO3-/K+外排介导的膜电位调控参与了高K+响应。电生理结果表明,SLAH3独立于其通道功能抑制GORK/SKOR的活性。该研究首次提出SLAH3对K+外排通道的两层调控机制:(1)SLAH3通过膜电位的变化调控电压依赖性K+通道;(2)SLAH3与GORK/SKOR相互作用,抑制其通道活性。揭示NO3-通道SLAH3与K+通道GORK和SKOR形成功能单元,通过协调氮-钾平衡来调节膜电位。
离子/分子流实验处理方法
1/2 MS和添加120 mM K+的1/2 MS水培液预处理5 h
膜电位实验处理:120 mM KCl或120 mM KNO3处理,实时测量
离子/分子流实验结果
(1)在高钾胁迫下SLAH3介导NO3-外排
为了进一步验证SLAH3介导的高钾耐受过程与NO3-相关,采用NMT检测Col-0和slah3根成熟区NO3-的流速。分别在1/2 MS和添加120 mM K+的1/2 MS水培液预处理5 h。1/2 MS预处理,slah3-3和slah3-4的NO3-外排量明显低于Col-0,这一结果与SLAH3作为NO3-外排通道的功能相一致。120 mM K+的1/2 MS预处理,Col-0和slah3的NO3-外排量显著升高,说明高K+诱导了NO3-外排。Col-0的NO3-外排通量明显高于slah3-3和slah3-4,说明高K+诱导的NO3-外排需要SLAH3(图1,A和B)。总的来说,在高钾胁迫下SLAH3介导NO3-显著外排。
图1 在高钾胁迫下SLAH3介导NO3-外排
(2)K+诱导的膜电位去极化在slah3突变体中降低
接下来,探索了SLAH3在高K+反应中介导NO3-外排的具体意义。阳离子和阴离子在植物细胞膜电位的建立和维持中至关重要。因此,采用NMT穿刺微电极技术研究SLAH3是否通过调节NO3-和K+平衡来调节膜电位。120 mM KCl和KNO3处理Col-0和slah3检测根细胞的膜电位的变化。将植株置于1/2 MS液体培养基中,加入120 mM KCl或KNO3处理。在Col-0中,高浓度的KCl处理会导致膜电位迅速而显著的去极化,而高浓度的KNO3处理导致较低程度去极化(图2,A和C)。以上结果表明,高浓度K+使膜电位去极化,NO3-使膜电位复极化。相比之下,KCl对slah3的膜电位去极化作用较小。有趣的是,KNO3导致slah3的膜电位去极化程度与KCl几乎相同,表明K+诱导的去极化在slah3中受损(图2,B和C)。以上结果表明,NO3-是调节植物膜电位的重要阴离子,更重要的是,SLAH3通过介导NO3-外排在调节膜电位中发挥着重要作用。
图2 K+诱导的膜电位去极化在slah3突变体中降低
(3)K+诱导的膜电位去极化在gork、skor突变体中增强
在高钾条件下,突变体slah3膜电势与WT相比去极化程度低。接下来探索了钾离子外排通道突变体gork和skor是否也参与膜电势调控过程。在0.5 g L−1 MES(pH 5.8)溶液中使用NMT刺穿微电极检测膜电位,然后在溶液中加入120 mM KNO3或120 mM KCl处理液记录膜电位的变化。与前期研究结果一致,与KNO3处理相比KCl在Col-0中引起了更强的去极化(图3 A)。突变体slah3的KCl处理与KNO3处理结果相似,去极化程度较低(图3,B、C和F)。与WT相比,当高浓度KCl处理时,gork和skor的去极化更强(图3,D、E和F)。这一结果表明钾离子外排通道GORK和SKOR参与了K+诱导膜电势调控过程。
图3 K+诱导的膜电位去极化在gork、skor突变体中增强
(4)SLAH3在K+诱导的NO3-和K+流出过程发挥重要功能
使用非损伤微测技术分析突变体中NO3-和K+的净通量。将WT、slah3、gork、skor、gork slah3和skor slah3在添加或不添加120 mM K+的1/2 MS液体培养基中预处理5小时后,使用NMT测量NO3-和K+的净通量。高K+预处理的Col-0植株NO3-净流出量显著增加。K+触发的NO3-外排在slah3中显著减少。gork和skor突变体表现出与WT相同的NO3-外排,在植物体内证明GORK和SKOR不影响SLAH3的活性。而gork slah3和skor slah3双突变体表现出与slah3相似的NO3-外排量(图4 A),这一结果证明在植物高钾胁迫应对过程中SLAH3位于GORK/SKOR的上游。
高K+预处理也引起了野生型和突变体K+外流的升高。在高K+预处理下,gork和skor突变体的K+外流弱于Col-0,这与GORK/SKOR蛋白功能相一致。值得注意的是,高K+预处理引发的K+外流在slah3中显著增强,在植物体内证明SLAH3抑制GORK和SKOR的功能(图4 B)。
图4 在野生型和突变体植株中,NO3-和K+的净通量
其他实验结果
- SLAH3功能缺失突变体特异的耐受高浓度K+
- SLAH3通过介导NO3-外排参与拟南芥氮-钾平衡过程
- 高K+导致植物体内N-K失衡
- 钾离子外排通道GORK/SKOR参与拟南芥应对高钾胁迫过程
- 钾离子外排通道GORK、SKOR与SLAH3有相互作用
- SLAH3抑制钾离子外排通道GORK和SKOR的活性
结论
该研究首次提出SLAH3对K+外排通道的两层调控机制:(1)SLAH3通过膜电位的变化调控电压依赖性K+通道;(2)SLAH3与GORK/SKOR相互作用,抑制其通道活性。揭示NO3-通道SLAH3与K+通道GORK和SKOR形成功能单元,通过协调氮-钾平衡来调节膜电位。
测试液
NO3-测试液:1 mM KNO3, 0.1 mM KCl, 0.1 mM CaCl2, 0.3 mM MES, pH 6.0
K+测试液:1 mM KCl, 0.1 mM CaCl2, 0.1 mM MgCl2, 0.5 mM NaCl, 0.3 mM MES, 0.2 mM Na2SO4, pH 6.0
膜电位测试液:1/2 MS或0.5 g L−1 MES(pH 5.8)溶液
NMT仪器信息
文章原文:https://doi.org/10.3390/ijms23094911
供稿:刘倍贝
编辑:叶斌,刘兆义
关键词:K+;NO3-;膜电位;氮-钾平衡;盐胁迫;拟南芥;根;植物类