中关村旭月非损伤微测技术产业联盟 - PBJ兰大万东石：NMT发现盐胁迫OSIC1正调控根排Na+速率为揭示其调控渗透胁迫诱导气孔关闭的机制提供证据

PBJ兰大万东石：NMT发现盐胁迫OSIC1正调控根排Na+速率为揭示其调控渗透胁迫诱导气孔关闭的机制提供证据

基本信息

主题：NMT发现C₂H₂-ZFP转录因子编码基因OSIC1在胁迫诱导气孔关闭中的相关机制

期刊：Plant Biotechnology Journal

影响因子：13.263

研究使用平台：NMT盐碱胁迫创新平台

标题：The C₂H₂-type zinc finger transcription factor OSIC1 positively regulates stomatal closure under osmotic stress in poplar

作者：兰州大学万东石，白秋仙，牛智敏，四川大学姜渊忠
获奖情况：该成果获得2022年度“中关村优秀NMT成果奖”二等奖

NMT文章作者点击申奖

检测离子/分子指标

Na⁺

检测样品

新疆杨根（距根尖顶点300 μm根表上的点）

中文摘要

盐和干旱会损害植物的渗透稳态，并极大地限制植物的生长和发育植物减少气孔开度以减少水分损失并保持渗透稳态，导致提高应激耐受性。此研究确定了新疆杨中被盐、干旱、聚乙二醇6000（PEG6000）和脱落酸（ABA）诱导的C2H2转录因子基因OSMOTIC STRESS INDUCED C₂H₂ 1 （OSIC1）。OSIC1过表达转基因杨树通过减少气孔孔径来对高盐、干旱和PEG6000处理具有更强的耐受性，而由CRISPR/Cas9系统介导产生的突变体表现出相反的表型。此外，OSIC1在体外和体内直接上调PalCuAOζ（编码含铜多胺氧化酶）的表达，以增强H₂O₂在保卫细胞中的积累，从而在胁迫时调节气孔关闭发生。此外，ABA、干旱和盐诱导的PalMPK3磷酸化OSIC1增加其对PalCuAOζ的转录活性。在转录和蛋白质水平上，OSIC1的这一调控保证杨树气孔快速关闭来对渗透压力做出反应。研究结果揭示了一种由OSIC1-PalCuAOζ介导的保卫细胞中H2O2产生的新的转录调控机制。这些发现加深了研究者对像杨树一样的多年生木本植物在应对盐和干旱引起的渗透胁迫做出反应时的了解，并提供育种的潜力目标。

离子/分子流实验处理方法

100 mM NaCl瞬时处理4周龄新疆杨幼苗根尖30 min

离子/分子流实验结果

通过非损伤微测技术（NMT）检测根系Na+流速发现，在盐胁迫下，植物会通过重建离子稳态来维持细胞的正常代谢，减轻盐胁迫造成的伤害。为了探究OSIC1是否参与了离子稳态的重建，作者检测了WT、OSIC1-OE和osic1-ko新疆杨根尖在100 mM NaCl 瞬时刺激下的 Na+外排情况。正常条件下，WT、OSIC1-OE和osic1-ko杨树根系Na+通量在±200 pmolcm-2s-1之间稳定波动，将其作为对照组（图1A）。与对照组相比，NMT实验分析表明盐处理导致这些杨树根系Na+通量的增加，但OSIC1-OE中Na+的外排变化最大，WT次之，而osic1-ko中的Na+外排变化最小（图1B），表明OSIC1-OE可以通过向外排更多的Na+来提高根部对盐胁迫的耐受性。

图1.OSIC1基因参与维持新疆杨根中Na⁺平衡。正值代表Na⁺外排，负值代表Na⁺内流。

其他实验结果

OSIC1正调控杨树盐胁迫的耐受性

作者通过农杆菌介导的杨树遗传转化体系，获得OSIC1过量表达（OSIC1-OE）和CRISPR-Cas9敲低（osic1-ko）的转基因新疆杨。正常生长条件下，与野生型新疆杨（WT）和osic1-ko株系相比，OSIC1-OE株系表现出多分枝多根系（图2），且在盐处理下，osic1-ko株系的盐胁迫耐受性受到极大损伤，而OSIC1-OE株系则表现出更强的盐耐受能力。因此，OSIC1-OE是杨树盐害耐受性的正调控基因。进一步发现，在盐胁迫下，OSIC1在气孔关闭中起积极作用（图3）。

图2. OSIC1-OE和osic1-ko杨树的生长状态

图3. OSIC1正调控杨树对盐胁迫的耐受性

OSIC1正调控杨树干旱胁迫的耐受性

此外，作者还追踪了干旱处理后杨树的表型、气孔导度、叶片蒸腾和净光合速率等气孔相关参数。结果表明，在干旱胁迫下，OSIC1通过正向调控气孔关闭来响应干旱胁迫（图4）。

图4. OSIC1正调控杨树对干旱胁迫的耐受性

OSIC1正调控ABA介导的气孔关闭

由于ABA诱导的OSIC1调控盐胁迫和干旱胁迫下的气孔关闭，作者提出OSIC1诱导气孔关闭与ABA信号通路有关。为了证明这一假设，作者对ABA处理的OSIC1-OE、osic1-ko和WT杨树的气孔孔径进行了观察和测量。当叶片浸泡在开放溶液(OS)中，气孔的长度、宽度和面积没有显著差异。但在ABA处理1.5 h后，过表达叶片的气孔宽度和面积减小最大，3 h后进一步减小，且突变体叶片的气孔面积最大(图5)。这些结果表明，OSIC1在ABA介导的气孔关闭中发挥了积极作用。

图5. OSIC1促进ABA诱导的气孔关闭

在盐、干旱和ABA处理下，OSIC1促进了保卫细胞中H₂O₂的积累

保卫细胞中H₂O₂的积累对气孔关闭至关重要。作者使用H₂O₂敏感的荧光染料检测了正常条件以及盐、PEG6000(模拟干旱)和ABA处理下的保卫细胞中内源性H₂O₂含量。在正常条件下，OSIC1-OE株系的荧光强度最高。经过盐、PEG6000(模拟干旱)和ABA处理后，过表达系的荧光强度明显增加，WT次之，OSIC1- ko系的荧光强度最弱(图6)。因此，OSIC1正向调控胁迫诱导的保卫细胞中H₂O2积累，来参与ABA信号传导。

图6. 不同处理下保卫细胞中H₂O₂含量检测

OSIC1靶定在PalCuAOζ的启动子上

为了确定OSIC1异位表达对杨树基因的影响，作者使用野生杨树、盐胁迫的野生杨树和非胁迫的OSIC1-OE杨树株系进行了RNA-seq分析。作者从异位表达OSIC1株系和盐胁迫野生杨树中均上调了的584个DEGs中发现了催化底物产生H₂O₂的铜胺氧化酶基因PalCuAOζ，推测其可能是导致H₂O₂积累的OSIC1转录因子的靶点。随后，作者通过酵母单杂交（Y1H）和凝胶迁移率实验（EMSA）技术证实OSIC1通过结合PalCuAOζ启动子上的OBE1和OBE3结合元件，直接激活PalCuAOζ的表达（图7）。因此，作者认为PalCuAOζ介导OSIC1增加保卫细胞中H₂O₂含量。为了确定这一点，作者通过CRISPR-Cas9系统分别在WT（pacuaoζ-ko）和OSIC1-OE杨树株系（pacuaoζ-ko/OSIC1-OE）下生成了PalCuAOζ敲除杨树。与WT相比，即使不使用ABA，palcuaoζ-ko和palcuaoζ-ko/OSIC1-OE杨树的气孔宽度和面积都有所增加。此外，ABA处理后气孔宽度和面积的减小幅度显著小于WT。这说明OSIC1通过调节PalCuAOζ的表达来调控ABA诱导的气孔关闭。此外，作者还检测了突变体杨树保护细胞中H₂O₂的含量。敲除PalCuAOζ后，即使提供ABA，H₂O₂含量也明显下降，过表达OSIC1也无法恢复(图8)。因此，诱导的H₂O₂的PalCuAOζ是OSIC1调控气孔关闭的必要条件，且PalCuAOζ是OSIC1的遗传上位。

图7. OSIC1通过结合到PalCuAOζ启动子的顺式作用元件上直接调控其表达

图8. OSIC1依赖PalCuAOζ介导气孔关闭和保卫细胞中H2O2的积累

磷酸化OSIC1可增强其转录激活活性

为了进一步阐明OSIC1的转录调控机制，通过酵母双杂交(Y2H)筛库鉴定OSIC1的相互作用蛋白。在候选蛋白中，作者发现了拟南芥丝裂原激活蛋白激酶(MPK3)的同源物，因此被命名为PalMPK3。点对点酵母双杂试验（Y2H）和免疫共沉淀试验(Co-IP)进一步确定了OSIC1和PalMPK3之间的相互作用。此外，磷酸化试验结果表明，PalMPK3在体外和体内均能磷酸化OSIC1（图9）。为了研究磷酸化的OSIC1对其转录活性的影响，作者使用双荧光素酶实验（LUC）证明磷酸化可以增强OSIC1的转录激活活性。此外，另一项LUC实验表明，共表达PalMPK3和PalMKK5DD的OSIC1确实显著增加了LUC强度；且随着NaCl浓度的增加，LUC强度进一步升高（图10）。这些结果表明，OSIC1具有其他的磷酸化位点，这些位点被其他盐胁迫诱导的蛋白激酶磷酸化。

图9.PalMPK3在体内或体外与OSIC1相互作用，并使其磷酸化

图10.PalMPK3在体内或体外与OSIC1相互作用，并使其磷酸化

结论

总之，该论文报道了杨树C₂H₂-ZFP转录因子编码基因OSIC1在胁迫诱导气孔关闭中的生物功能。首先，OSIC1主要在叶片和木质部表达，且受盐、干旱、PEG6000和ABA诱导显著；第二，在转基因杨树中，OSIC1在杨树耐盐和干旱胁迫中发挥积极作用，并引起全面的转录组重排；第三，OSIC1通过上调PalCuAOζ的表达加速H₂O₂积累，导致气孔关闭。最后，OSIC1可以被PalMPK3磷酸化以增强其转录活性。因此，作者提出了一种新的杨树对渗透胁迫响应的工作模型：正常情况下，PalMPK3和OSIC1的mRNA丰度维持在较低水平，其编码产物失活；因此，PalCuAOζ的转录没有被大量激活。因此，H₂O₂含量不足以促使气孔关闭。当杨树遭受到盐或干旱造成的渗透胁迫时，ABA会积累。积累的ABA诱导PalMPK3和OSIC1的表达，并激活PalMKK4/5，进一步磷酸化PalMPK3。随后，OSIC1被激活的PalMPK3磷酸化。磷酸化的OSIC1结合到PalCuAOζ的启动子上并上调其表达。PalCuAOζ催化生成更多H₂O₂，从而介导气孔关闭，减少水分流失（图11）。这些研究成果不仅加深了木本植物对渗透胁迫响应调控机制的理解，也为逆境胁迫下杨树种质的筛选和培育提供了新思路和理论依据。