BMC Plant Biol河北师大：NMT发现ABA诱导根吸Ca²⁺ 为探究OsANN4响应ABA的机制提供证据

基本信息

主题：NMT发现ABA诱导根吸Ca²⁺ 为探究OsANN4响应ABA的机制提供证据

期刊：BMC Plant Biology

影响因子：4.215

研究使用平台：NMT植物激素创新平台

标题：OsANN4 modulates ROS production and mediates Ca²⁺ influx in response to ABA

作者：河北师范大学朱正歌、张倩

检测离子/分子指标

Ca²⁺

检测样品

水稻根

中文摘要

背景：植物膜联蛋白是具有多种功能的钙、脂结合蛋白，近年来对植物膜联蛋白的研究已有大量报道。然而，膜联蛋白在水稻不同生物学过程中的功能还不清楚。

结果：本文研究了脱落酸（ABA）诱导的钙结合水稻膜联蛋白OsANN4。在ABA处理下，RNAi敲除OsANN4的植株与野生型相比，表现出一些明显的表型变化，如生根率较低、地上部分和根长较短。此外，RNAi株系的超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化氢酶（CAT）活性显著低于野生型，进一步导致O₂^.-和H₂O₂的积累。非损伤微测技术（NMT）的实验结果表明，在OsANN4敲除植株中ABA诱导的净Ca²⁺内流受到抑制。在LaCl₃（Ca²⁺通道抑制剂）存在下，ABA引起的表型差异被消除。除此之外，研究还证明OsCDPK24与OsANN4相互作用并磷酸化。当OsANN4的磷酸化丝氨酸残基被丙氨酸取代后，仍可观察到OsANN4与OsCDPK24的相互作用，但OsANN4的构象及其与Ca²⁺的结合活性均可能发生改变。

结论：OsANN4部分通过调节ROS产生、介导Ca²⁺内流或与OsCDPK24相互作用在ABA应答中发挥重要作用。

离子/分子流实验处理方法

30 μM ABA处理0.5 h

离子/分子流实验结果

为了检测OsANN4是否参与了Ca²⁺瞬时变化，研究使用NMT检测了3日龄WT、RNAi和OE植株在30 μM ABA处理0.5 h后分生区Ca²⁺流速。在没有外源ABA处理的情况下（图1a），WT根部显示较弱的Ca²⁺外排，而OsANN4-RNAi和OsANN4-OE根部显示Ca²⁺内流。经ABA处理后（图1b），所有株系根部均显示Ca²⁺内流，OsANN4-RNAi植株的Ca²⁺内流速率低于WT和OsANN4-OE植株。与未处理的植株相比，WT和OsANN4-OE根系细胞外Ca²⁺的内流速率显著提高，而OsANN4-RNAi根中细胞外Ca²⁺的内流速率没有明显变化。数据表明，OsANN4可能介导Ca²⁺内流并参与对ABA的应答。

图1.敲除OsANN4抑制了ABA诱导的水稻根尖Ca²⁺内流。正值代表Ca²⁺外排，负值代表Ca²⁺吸收。

其他实验结果

OsANN4对ABA有响应。系统发育分析表明，LOC_Os05g31750是AtANN4的同源物，因此它被命名为OsANN4；此外，研究用10 μM ABA处理7日龄野生型幼苗，检测了其分别在0 h、0.5h、1 h、3 h、6 h、12 h和24 h时OsANN4的表达情况。ABA处理诱导OsANN4的表达，并在处理6 h后达到最高的表达水平；此外过表达株系经10 μM ABA处理后，OsANN4蛋白逐渐增加；ABA处理抑制OsANN4-RNAi植株的生长，在ABA存在的情况下，OsANN4-RNAi植株的地上部分和根长均显著低于WT和OsANN4-OE植株。这些数据表明，OsANN4可能在水稻对ABA信号的响应中起着关键作用。
OsANN4调节抗氧化酶活性和ROS的产生。OsANN4-RNAi株系的SOD和CAT活性与WT植株无明显差异；经过ABA处理后，OsANN4-RNAi株系的SOD和CAT活性均显著低于WT植株；ABA处理/不处理1 h后，进一步检测7日龄水稻幼苗的过氧化氢含量，结果显示，OsANN4-RNAi基因株系的过氧化氢含量明显高于WT基因株系；外源ABA处理后，与WT和OsANN4-OE株系相比，OsANN4-RNAi细胞的蓝点(O₂^.-产生)或棕色点（H₂O₂产生）显著增加。结果表明，在外源ABA处理下，水稻中O₂^.-和过氧化氢的产生与OsANN4的表达有关。
OsANN4是一种位于细胞外周的Ca²⁺结合蛋白。在315 nm的激发下，荧光发射光谱在390 nm处显示最大荧光波长，其中荧光强度达到约2000 A.U.；加入2 mM Ca²⁺后，再次测定OsANN4-His重组蛋白的最大荧光强度，结果表明最大荧光波长保持不变，而荧光强度发生了变化，表明OsANN4具有Ca²⁺结合活性，并可能会进一步改变该蛋白的构象。
OsANN4可能介导了ABA诱导的Ca²⁺流。LaCl₃作为Ca²⁺通道抑制剂，可以抑制Ca²⁺在外质体和细胞质之间的流量；在LaCl₃存在的情况下，ABA引起的生根速率的差异减少；18 d后，无论添加0、10 μM或20 μM ABA，所有植物间均无明显的表型差异；统计结果表明，ABA引起了OsANN4-RNAi植株的表型差异。这些结果表明，Ca²⁺的内部转运在水稻对ABA的响应中发挥着重要作用，而OsANN4参与了ABA诱导的Ca²⁺内流。
OsANN4与蛋白激酶OsCDPK24相互作用。为了进一步了解OsANN4是如何对ABA产生响应的，研究使用酵母双杂交试验验证了几个潜在的水稻蛋白激酶候选基因，其中OsCDPK24(Os11g0171500)是ABA响应的关键调控因子，与OsANN4有很强的相互作用；OsANN4-GST pulled down和荧光素酶互补成像（LCI）实验进一步证明了OsANN4与OsCDPK24之间的相互作用。
OsANN4被OsCDPK24磷酸化。加入5 μM和500 μM Ca²⁺后，OsANN4的磷酸化水平略有升高，表明，OsANN4可以被OsCDPK24磷酸化，钙信号可以促进OsCDPK24对OsANN4的磷酸化过程；质谱结果表明，OsANN4可以被OsCDPK24磷酸化，而OsANN4的磷酸化位点是第13位氨基酸，一个丝氨酸；荧光素酶互补成像结果表明，磷酸化位点的突变可能不会影响OsANN4与OsCDPK24之间的相互作用；在315nm处的激发下，观察到OsANN4(S13A)-His和OsANN4的荧光发射光谱相同，然而，荧光强度有所不同；与OsANN4的荧光强度明显增加相比，加入 Ca²⁺后，OsANN4(S13A)-His的荧光强度明显降低，表明磷酸化位点的突变可能会影响OsANN4的构象，进而导致其与 Ca²⁺的结合活性的改变。